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AJACS世田谷

次世代シーケンサー（NGS）と関連するデータベースツール

大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構
データサイエンス共同利用基盤施設
ライフサイエンス統合データベースセンター
仲里 猛留
[email protected]
twitter: @chalkless

2019年11月29日（金） 東京農業大学 世田谷キャンパス

AJACS世田谷 > 次世代シーケンサー（NGS）と関連するデータベースツール

次世代シーケンサ（とそのデータ）基礎知識

  • 言葉
    • 次世代シーケンサ
    • 次世代シーケンサー
    • 新型シーケンサ
    • New-generation Sequencing (NGS)
    • Next-generation Sequencing (NGS)
    • 他にmassively parallel DNA sequencing とか...
    • 最近は、 High-throughput DNA sequencing (technology) をよく使う印象（略語はNGS）

何が新型／次世代なのか?

  • 90年代
    • ゲル板
    • ポリアクリルアミドゲル電気泳動 + 蛍光標識ダイデオキシヌクレオチド

© 2011 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 ←クレジットをいれれば、転載・改変・再利用 OK

developments-in-high-throughput-sequencing-july-2016-edition 2016年7月時点でのシーケンサー各社の公称スペックをプロットしたもの (引用: Developments in high throughput sequencing – July 2016 edition, https://flxlexblog.wordpress.com/2016/07/08/developments-in-high-throughput-sequencing-july-2016-edition/ )。

NGSデータの規模

  • 【実習】どのくらいのデータ量になるか考えてみましょう
    • ゲル板：750 (base/lane) × 48/4 lanes = 9kbase
    • キャピラリ：500 (base/lane) × 96 lane = 48kbase
    • 次世代： 36 (base/seq) × 300M seq/run = 10.8Gbase = 10,800,000kbase
    • ↑これらの数字は規模感をつかむだけなので、ざっくりな数字になっています（1 runにかかる時間は比較してないですし）
    • ↑これらの数字は「塩基数」であって、シーケンサの出力である「画像データ」のデータサイズでないことに注意！
    • そして、その画像データはSRAには登録されていない

NGSの利用範囲

  • ゲノム、発現解析、メタゲノム解析、ChIP-Seq（転写因子解析）、SNP解析、...
    • 目的によって必要なデータ量も違う
    • 機器に合った利用を

公共NGSデータベース

解析の概略

参考リソース

実際の解析1：クオリティチェック・トリミング

  • クオリティチェックには主にFASTQCというツールが使われます。
    トリミングはさまざまなツールがあります（今回はtrim_galoreで例を示しています）

  • 入力データ：FASTQフォーマット

  • [参考] FASTAフォーマット

  • 場合によっては（NCBIからダウンロードしたときなど）サイズ削減などのため、sra形式で圧縮されている場合があります。そのときはsra-toolkitでFASTQファイルを取り出したりします

  • コマンド例

    • クオリティチェック

    $ fastqc --nogroup -o DRR1234567.fastq

    • トリミング

    trim_galore --paired --illumina --fastqc -o trimmed/ DRR1234567.R1.fastq DRR1234567.R2.fastq

  • 結果例

    • HTMLファイルができると思ってください
    • 今回、発現解析のところで用いるデータ（デスクトップ＞AJACS_OWARI）の中にも実際のものがあります
    • DBCLS SRAではあらかじめFastQCをかけた結果を表示できるように随時、処理をしています（自分でやらなくてよい！）
    • 例： http://sra.dbcls.jp/search/view/SRR067385

実際の解析2−1：発現解析（mapping）

  • ゲノムなどのリファレンス配列にNGSデータをマッピングします

  • bowtie、tophat2などなどさまざまなツールがあります

  • 発現解析程度なら速度重視、SNP解析なら精度重視とツールも変わります

  • 名前が違うだけで、中身は複数のツールの組み合わせということも多々あります

  • コマンド例：マッピング

    hisat2 -f -p 24 -x genome.idx -U DRR1234567.trimmed.fasta -S results.sam

  • 結果：sam/bamフォーマット

  • コマンド例：形式変換

  • マッピングはsam形式かbam形式で出力されます
    samは人間が読めるがサイズが大きいです。bamはプログラムで扱えるように（サイズを小さくするためにも）なっていますが人間には読めません

    samtools view -Sb SRR1294107.sam -o SRR1294107.bam （SAMからBAMへの変換）

    samtools view -h SRR1294107.bam -o SRR1294107.sam （BAMからSAMへの変換）

実際の解析2−2：発現解析（de novo）

  • 特に非モデル生物を扱う場合など、ゲノム情報がない場合は、RNA-Seqの発現データをリードだけでつなぎtranscriptを得る

  • Trinity を用いる

  • コマンド例

    $ Trinity --seqType fq --left DRR1234567.R1.fastq --right DRR1234567.R2.fastq --max_memory 24G --CPU 16

  • 結果例

    $ head trinity_out_dir/Trinity.fasta
>TRINITY_DN0_c0_g1_i1 len=390 path=[735:0-389] [-1, 735, -2]
AAACTTCATAGATGAAATAAATGCTCATATACTATGTAGAAAATCTCCACATATATAAAA
CAAAACATTTTGCTTTAAAACAGATATGATCACTAGGTGCAATGGCCTAATTCCCTGGCT
…

  • DNxxx_cXXX がクラスタとしてまとまったもの。-gXXXの部分が遺伝子、_iXXXがisoformに対応

実際の解析2−3：その後の発現解析

  • 発現量解析
  • 遺伝子機能アノテーション
    • BLASTで類似性のある遺伝子を検索
    • hmmerでドメインサーチ
    • → Trinityの関連でのアノテーションづけのページが非常に役立つ
      https://trinotate.github.io/

実際の解析3−1：SNV/Indel解析

  • 基本的にはmappingと同様。ただし、1塩基のずれも重要なので（場合によってはmappingでのツールで大雑把にアラインメントをとった後）精度重視でのmappingを行う。その後、variantの解析を行う。

  • 結果：vcfデータ（variant call format）

実際の解析3−2：ChIP-Seq

実際の解析3−3：メタゲノム

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